Investigación – Cátedra de Fisiopatología

Breve descripción: La autofagia es un proceso catabólico importante que media la degradación de las organelas y macromoléculas celulares y permite el reciclaje de componentes bioenergéticos para las necesidades metabólicas celulares. Vías no canónicas como la autofagia secretora, pueden ocurrir en enfermedades como el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) y formar parte de la vesículas extracelulares (EV) presentes en sangre de los pacientes con cáncer pancreático. Esta fracción de EV puede originarse en los autofagosomas que se sometieron a la vía secretora en lugar de su destino canónico de degradación autolisosómica. En consecuencia, la presencia de EV relacionadas a autofagia en la sangre del paciente PDAC puede tener un importante valor diagnóstico y pronóstico. Sin embargo, el papel fisiopatológico de este fenómeno no está totalmente dilucidado. La proteína relacionada a autofagia y asociada a pancreatitis VMP1 es una proteína de la membrana del autofagosoma, y es fuertemente inducida en células tumorales pancreáticas por hipoxia y por quimioterapia. Resultados preliminares muestran la presencia de VMP1 en la fracción EV del suero humano actuando como proteína de superficie de las vesículas extracelulares relacionadas a autofagia. El presente proyecto de doctorado tiene como objetivo abordar específicamente la influencia de la autofagia en la secreción sistémica, el contenido y la función de vesículas extracelulares en el contexto del adenocarcinoma pancreático.

Responsable: Vaccaro Maria Ines – mvaccaro@ffyb.uba.ar

Breve descripción: La infección por COVID19 cursa con diversas manifestaciones clínicas que incluyen casos asintomáticos, enfermedad respiratoria leve a moderada, cuadros respiratorios graves y casos severos caracterizados por compromiso sistémico multiorgánico grave que puede llevar a la muerte a un porcentaje alto de los individuos afectados. En estos casos que comprometen la vida, los pacientes desarrollan a menudo un complejo fenómeno inmune-inflamatorio que parece explicar buena parte de la severidad del cuadro y al que se asigna una alta cuota de mortalidad.

La autofagia es un proceso normal en las células y muy importante, ya que media la degradación de los orgánulos y macromoléculas celulares y recicla los componentes bioenergéticos para las necesidades metabólicas celulares, y también funciona como una respuesta al estrés celular causado por enfermedades complejas permitiendo el reciclaje de proteínas y organoides dañados y la generación de nuevas fuentes de energía.

Una serie de mecanismos vinculados a la autofagia se han relacionado con la regulación de unas estructuras membranosas llamadas vesículas extracelulares (EV). EV son pequeñas vesículas derivadas de la membrana plasmática o del interior celular, que pueden encontrarse en el plasma de pacientes de diversas enfermedades, así como en personas sanas, pero la composición de las EV puede variar frente a diversas situaciones clínicas, como podría serlo la infección por COVID19. Los potenciales beneficios clínicos de estas fracciones del suero de los pacientes, (más allá de los anticuerpos neutralizantes) conforman el área de interés de esta propuesta de trabajo. En especial, el rol de las partículas (EV).
La proteína de transmembrana VMP1 (Vacuole membrane protein 1), es esencial para la formación del autofagosoma y por lo tanto para el flujo autofágico. VMP1, se halla presente en algunas EV. De hecho, la VMP1 presente en EV las caracteriza como ‘EV-VMP1’. La proteína VMP1 se asocia con numerosas enfermedades inflamatorias y ha sido profundamente estudiada por nosotros en varias entidades y situaciones clínicas incluyendo, de manera especial, la pancreatitis aguda.
VMP1 desencadena la autofagia y es esencial para el desarrollo de este proceso; actúa como un mecanismo de defensa en pancreatitis aguda, una enfermedad compleja y muy dolorosa que en la mayor parte de los pacientes es leve y autolimitada, pero en un porcentaje menor puede presentarse como una forma severa y letal; además la expresión de VMP1 previene la muerte celular, la respuesta inflamatoria y la falla de otros órganos como el pulmón y el riñón que se presentan en la enfermedad severa, consecuencia probable de un mecanismo inmune-inflamatorio de algún modo similar al registrado en enfermedad severa por COVID19 que se desarrolla en pacientes con pancreatitis aguda grave.
EV-VMP1 podría estar elevada en las personas que han sobrevivido a la infección y se hallan en condición de convalecientes. Y podría explicar al menos en parte el beneficio clínico del suero de convalecientes por encima de la administración de inmunoglobulinas hiperinmunes.

El objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión de VMP1 en pacientes con COVID convalecientes y controles (voluntarios negativos para COVID-19) y aislar Vesículas Extracelulares (EV) que expresan VMP1 del suero de estos pacientes.

Responsable: Vaccaro Maria Ines – mvaccaro@ffyb.uba.ar

Breve descripción: El SUH ocasionado por E. coli productor de toxina Shiga (Stx2), es la causa más común de lesión renal aguda (LRA) en niños menores de 5 años en Argentina. Es endémico y es la segunda causa de lesión renal crónica (LRC) y de trasplante renal en niños y adolescentes. Nuestra hipótesis es que durante el daño renal se activan mecanismos intracelulares implicados tanto en la evolución a la regeneración y curación como en el desarrollo de secuelas y fibrosis, modulados de tal forma que actúan en uno u otro sentido, dependiendo del grado de la lesión renal. Por lo tanto, el objetivo general del proyecto es estudiar la progresión hacia la regeneración del epitelio tubular y la reparación o hacia la cronicidad de la enfermedad renal, luego del daño causado por Stx2 y evaluar si hay diferencias de género en estos procesos. Para ello, se utilizará un modelo subletal de SUH en ratas macho y hembra Sprague Dawley juveniles inoculados intraperitonealmente con distintas dosis de sobrenadantes filtrados de bacterias recombinantes conteniendo Stx2 y se investigará su evolución en el tiempo respecto al balance entre los mecanismos pro-fibróticos que llevan a la LRC y los de regeneración que lleva a la reparación, algunos de los cuales son comunes a ambos procesos. Para profundizar en la investigación de los mecanismos celulares e intracelulares se desarrollarán cultivos primarios de células epiteliales tubulares de riñón humano y de podocitos de rata

Responsable: Zotta Elsa – ezotta@ffyb.uba.ar

Breve descripción: El retículo endoplásmico (RE) es responsable de la síntesis y correcto plegamiento de las proteínas transmembrana, citosólicas y de exportación. Distintos factores afectan su función provocando acumulación de proteínas no plegadas o mal plegadas en el lumen, condición denominada estrés del RE. Para restaurar la homeostasis las células poseen sistemas integrados de señalización altamente conservados que incluyen la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) y la degradación asociada al RE (ERAD). Estos mecanismos desencadenan vías de señalización que tienden a disminuir la síntesis proteica global y favorecer la degradación de las proteínas mal plegadas, pero si el estrés es intenso o persistente, estas vías llevan a la muerte celular programada. Estudios recientes muestran que el estrés del RE constituye un evento temprano en la patogenia de distintas enfermedades de naturaleza no relacionada por lo que los componentes de la UPR están emergiendo como posibles blancos terapéuticos. En nuestro laboratorio estudiamos el efecto beneficioso del péptido natriurético atrial y las endotelinas en la colestasis hepatocelular y la pancreatitis aguda, con énfasis en el estrés del RE y mecanismos asociados como el estrés oxidativo y la inflamación. Avanzar en el conocimiento de cómo las células reaccionan al estrés del RE podría acelerar el descubrimiento de drogas para el tratamiento distintas patologías, así como también identificar marcadores de pronóstico.

Responsable: Bianciotti, Liliana Graciela – lbianc@ffyb.uba.ar

Breve descripción: Nuestro grupo de trabajo ha investigado y continúa investigando los mecanismos de modulación de los transportadores de la familia ABC (Adenosine Binding Cassette) implicados en el transporte de drogas en varios órganos (hígado, intestino y cerebro), bajo diversas condiciones fisiopatológicas. Estas condiciones incluyen modelos de colestasis, síndrome metabólico y la exposición a agentes farmacológicos como la espironolactona o la intoxicación con paracetamol (APAP). Los transportadores de drogas ABC son bombas de eflujo ubicadas en la membrana plasmática de los epitelios, como el intestino, y regulan el paso y el contenido intracelular de sustancias tanto exógenas (fármacos) como endógenas (glutatión, AMPc). Actualmente, estamos centrados en entender el papel de MRP4/ABCC4 dependiendo de su localización subcelular, así como su función en los procesos de proliferación y diferenciación en modelos de neoplasia como las líneas celulares de PDAC, y en un modelo fisiopatológico de relevancia clínica no canceroso, como la intoxicación con APAP.

Responsable: Ghanem, Carolina – cghanem@ffyb.uba.ar

Breve descripción: El Adenocarcinoma Ductal Pancreático (PDAC) constituye una de las neoplasias malignas con peor pronóstico dada la dificultad de efectuar un diagnóstico temprano y la alta malignidad de las células tumorales, lo que conlleva una diseminación muy precoz y una alta resistencia a agentes quimioterápicos. La autofagia permite el mantenimiento de la homeostasis celular mediante la degradación lisosomal de componentes celulares como organelas dañadas y agregados proteicos. Si bien en estadios tempranos la autofagia evita la progresión del PDAC, en estadios avanzados la autofagia desregulada le permite al tumor sobrevivir a condiciones adversas favoreciendo su progresión y la resistencia a quimioterapia. Hemos caracterizado a VMP1 como una proteína transmembrana esencial para la autofagia cuya expresión en el páncreas aumenta ante el estrés. En el PDAC, la mutación G12D del KRAS induce expresión de VMP1 mediante una vía que involucra a la histona acetiltransferasa EP300 y al factor de transcripción E2F1. El aumento de expresión de VMP1 induce autofagia conduciendo a la resistencia al quimioterápico gemcitabina. En la búsqueda de mecanismos que regulen la funcionalidad de VMP1, resultados aún no publicados muestran a la ubiquitinación como una nueva modificación postraduccional de VMP1, la cual se encuentra presente durante todo el proceso autofágico. En este proyecto nos propondremos profundizar en los mecanismos por los cuales VMP1 influye en la malignidad del PDAC. Para esto, mediante la aplicación de ensayos sobre líneas celulares derivadas de PDAC evaluaremos si además de la resistencia a drogas VMP1 media otros aspectos de la malignidad tumoral como las capacidades de migración, invasión y proliferación. Los resultados obtenidos serán confirmados en modelos de esferoides celulares tumorales heterotípicos. A su vez, utilizando los mencionados modelos, evaluaremos el rol que cumple la ubiquitinación en la modulación de la funcionalidad de VMP1 en la malignidad celular pancreática. De esta manera, esperamos descubrir nuevos aspectos mecanísticos que nos indiquen con certeza los roles que juega VMP1 dentro de la malignidad tumoral pancreática y los mecanismos que pone en juego la célula para poder regularlos. La dilucidación de los mecanismos que explican la alta malignidad en el PDAC así como su regulación interna nos proporcionará nuevos targets moleculares sobre los cuales poder desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.

Responsable: Renna Felipe

Breve descripción: La mayoría de los ataques de pancreatitis aguda (PA) son leves y autolimitados, aunque en algunos casos la reacción inflamatoria local progresa a un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) y a la disfunción orgánica responsable de la severidad de esta enfermedad. La respuesta de la célula acinar pancreática y la activación del inflamasoma en los macrófagos se asocian al desarrollo de SIRS. Esta respuesta involucra la expresión de VMP1 e IP15, genes caracterizados por nuestro laboratorio por su fuerte expresión durante la PA. La autofagia mediada por la expresión de VMP1 degrada selectivamente los gránulos de zimógeno alterados mediante zimofagia y por mitofagia las mitocondrias dañadas durante la PA. IP15 inhibe la proliferación celular y su localización subcelular es dependiente de la estimulación por interferón. En este proyecto se propone el estudio de los mecanismos moleculares implicados en la función de estas proteínas y su participación en el desarrollo de la respuesta inflamatoria local. Nuestro modelo de trabajo será la PA experimental inducida por ceruleina (CAE) en ratón y células AR42J, línea celular derivada de células acinares pancreáticas. In vitro, utilizaremos modelos de expresión estable, de silenciamiento mediante estrategia de RNAi y KO utilizando CrispR-Cas9. Evaluaremos el efecto de la expresión y el silenciamiento de VMP1 sobre la expresión de las citoquinas proinflamatorias TNF-a e IL-6. Utilizaremos la línea de monocitos THP1 y los activaremos mediante el tratamiento con LPS y ATP. Para determinar la activación del inflamasoma analizaremos la expresión de IL-1B y caspasa-1 mediante western blot. De esta manera, analizaremos cómo afecta la activación del inflamasoma la expresión y el silenciamiento de VMP1. Analizaremos el efecto del silenciamiento de IP15 sobre la proliferación y viabilidad celular mediante ensayos de MTT y clonogénicos en placa. Estudiaremos los mecanismos implicados en la inhibición de la proliferación celular mediada por la expresión de IP15 utilizando inhibidores de quinasas conocidas. In vivo, analizaremos la expresión de estos 2 genes y su posible función en modelos de pancreatitis leves y severas con el fin de analizar su relación con la severidad de la enfermedad. La comprensión de los procesos fisiopatológicos que a su tiempo conducen a la progresión de la enfermedad, la inflamación local o la complicación sistémica posibilitará abordar nuevas y más eficientes estrategias terapéuticas.

Responsable: Ropolo Alejandro Javier – aropolo@ffyb.uba.ar

Breve descripción: Nuestro trabajo se centra en los mecanismos moleculares que las células ponen en marcha en respuesta a enfermedades multifactoriales. La autofagia es un proceso que la célula pone en marcha para mantener la función celular degradando proteínas y orgánulos intracelulares durante el estrés y ha sido relacionada a una variedad de procesos patológicos. Identificamos a VMP1como proteína relacionada a la autofagia y descubrimos que gatilla autofagia y es esencial para la formación del autofagosoma. Demostramos que VMP1 media un nuevo tipo de autofagia selectiva que actúa como mecanismo de defensa en la pancreatitis aguda y que está inducida en el adenocarcinoma pancreático humano participando de los mecanismos de resistencia a la muerte de las células tumorales pancreáticas. Caracterizamos la interacción de VMP1 con proteínas de membrana plasmática describiendo un nuevo sitio de iniciación de la autofagia. La autofagia es un proceso degradativo pero recientemente se ha relacionado con la regulación de la secreción no-convencional de vesículas extracelulares (estructuras membranosas). Contamos con evidencia experimental que indica que VMP1 puede ser secretada en forma no-convencional por autofagia secretora, formando parte de la fracción de vesículas extracelulares. Actualmente estudiamos los pasos moleculares en que VMP1 interviene en las vías de transporte vesicular relacionadas a la autofagia, su regulación y su función en patologías complejas, de alta morbi-mortalidad como la pancreatitis y el adenocarcinoma pancreático

Responsable: Vaccaro, María Inés – mvaccaro@ffyb.uba.ar

Breve descripción: El estrés celular regula la autofagia selectiva y el tráfico vesicular para mantener la homeostasis y hacer frente a condiciones patológicas como la pancreatitis aguda. Uno de estos mecanismos implica la secreción no convencional de vesículas extracelulares (VE), partículas delimitadas por bicapa lipídica liberadas por casi todos los tipos de células al medio extracelular. Recientemente, se ha descubierto una vía secretora relacionada con la autofagia que libera VE. Nuestro estudio se centra en la proteína de membrana vacuolar 1 (VMP1), una proteína relacionada con la autofagia implicada en la pancreatitis, el cáncer de páncreas y el manejo del estrés celular. La expresión de VMP1 desencadena la autofagia en células de mamíferos a través de su ubiquitinación y su unión directa a BECN1. Aquí, demostramos que VMP1 se secreta al medio extracelular integrado en la membrana de las VE. Utilizando líneas celulares que expresan diferentes variantes de la etiqueta VMP1, aislamos y purificamos con éxito VE que contienen VMP1 (VE-VMP1) del medio extracelular mediante técnicas de ultracentrifugación y aislamiento inmunológico. La secreción de las EV de VMP1 depende de fármacos moduladores de la autofagia y de proteínas esenciales para la formación del autofagosoma, como ATG5. La secreción de VMP1 endógena por las células acinares pancreáticas fue altamente inducida en modelos experimentales de estrés celular, incluyendo el flujo autofágico bloqueado con Bafilomicina y la exposición a dosis supramáximas de ceruleína. Además, el inmunoaislamiento de las EV de VMP1 a partir de modelos celulares reveló que VMP1 es un componente de las membranas de las EV. El análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión dinámica de luz (DLS) de las EV de VMP1 inmunoaisladas indicó un diámetro de alrededor de 150 nm, mientras que el ensayo de transferencia Western demostró que la proteína relacionada con la autofagia LC3-II y p62 son parte del contenido de las EV de VMP1. Además, las EV de VMP1 son absorbidas por diferentes células huésped, lo que sugiere que las EV de VMP1 pueden ser capaces de mediar la comunicación remota entre células. En conclusión, hemos demostrado por primera vez que la proteína transmembrana asociada a la pancreatitis VMP1 se secreta de manera no convencional como un componente de vesículas extracelulares a través de una vía de autofagia secretora.

Responsable: Tadic Mariana